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晶誠CrystaroseC FF填料測試報告

發布時間: 2016-08-24

　　1、儀器以及耗材

　　1.1 儀器：JC-1自動化蛋白純化系統(晶誠)

　　1.2 色譜柱：XK16(GE)

　　1.3晶誠生物(wù)科(kē)技(jì )：CrystaroseC FF(5ml)

　　1.4 GE:Chelating FF(5ml)

　　2、緩沖溶液配制

　　2.1 平衡緩沖溶液：20mM Tris-cl,300mM NaCl,PH8.0

　　2.2 洗脫緩沖溶液1:20mM Tris-cl,300mM NaCl,50mM Imidazole ,PH8.0

　　2.3 洗脫緩沖溶液2:20mM Tris-cl,300mM NaCl,100mM Imidazole ,PH8.0

　　2.4 洗脫緩沖溶液3:20mM Tris-cl,300mM NaCl,250mM Imidazole ,PH8.0

　　2.5 洗脫緩沖溶液4:20mM Tris-cl,300mM NaCl,500mM Imidazole ,PH8.0

　　3、操作(zuò)步驟：

　　3.1.晶誠CrystaroseC FF填料測試：

　　3.1.1 将色譜柱用(yòng)去離子水清洗幹淨後，倒入約5ml左右的CrystaroseC FF.用(yòng)平衡緩沖溶液平衡層析柱，流速為(wèi)5ml/min.

　　3.1.2 凝膠完全沉降後，在凝膠的水平面位置用(yòng)記号筆(bǐ)在層析柱上畫一個橫線(xiàn)。

　　3.1.3 下壓層析柱上調節轉換器，使之和填料表面接觸即可(kě)

　　3.1.4 進樣，流速3ml/min,總樣品體(tǐ)積為(wèi)20ml.

　　3.1.5 用(yòng)平衡緩沖溶液沖洗層析柱直至接近基線(xiàn)平行。

　　3.1.6 洗脫，依次用(yòng)不同濃度的洗脫緩沖液洗脫，手機洗脫溶液。

　　3.2 GE Chelating FF測試

　　3.2.1、将晶誠的CrystaroseC FF填料全部倒出，拆開層析柱，先用(yòng)自來水沖洗層析柱的柱管和上下篩網，再用(yòng)去離子水沖洗層析柱。重新(xīn)組裝(zhuāng)層析柱後倒入GE公(gōng)司的Chelating FF填料。

　　3.2.2、去掉多(duō)餘的填料，沉降後的填料上表面和柱管表面記号線(xiàn)保持水平位置，用(yòng)平衡緩沖溶液平衡層析柱。

　　3.2.3、後面的步驟同3.1.3---3.1.6.

　　4、結果分(fēn)析：

　　4.1 通過對晶誠生物(wù)科(kē)技(jì )生産(chǎn)的CrystaroseC FF和GE公(gōng)司的産(chǎn)品Chelating FF比較發現，兩種填料通過金屬螯合親和層析後均能(néng)夠得到較高純度的目的蛋白。但是在色譜圖上，CrystaroseC FF的出峰時間較晚，Chelating FF在100mM 濃度的Imidazole洗脫時就有(yǒu)大量的目的蛋白被洗脫，占到總洗脫蛋白的65%,剩下的35%蛋白在250mM濃度的Imidazole被洗脫，在50mM濃度的Imidazole洗雜步驟時也有(yǒu)部分(fēn)蛋白被洗脫。CrystaroseC FF的洗脫時間普遍偏晚，在10%洗雜步驟隻有(yǒu)極少的目的蛋白被洗脫，絕大部分(fēn)蛋白在250mM 濃度的Imidazole被洗脫，其占到總洗脫蛋白的82%.在100mM和500mM濃度的Imidazole時有(yǒu)少部分(fēn)蛋白被洗脫。所以，CrystaroseC FF對蛋白的吸附能(néng)力較強，保留時間相應增加。這一特性可(kě)以大大提高填料的純化性能(néng)。比如純化一些對Ni柱親和力較弱的蛋白，普通的Ni柱不結合或者結合很(hěn)弱，在洗雜時随着雜蛋白一起被洗脫，難以得到有(yǒu)效的分(fēn)離。如果使用(yòng)CrystaroseC FF填料純化的話就有(yǒu)可(kě)能(néng)會被有(yǒu)效吸附從而得到分(fēn)離純化。

　　4.2 兩種填料在蛋白收率方面也有(yǒu)區(qū)别，CrystaroseC FF總洗脫蛋白為(wèi)33.9mg,Chelating FF的總洗脫蛋白為(wèi)29.8mg.在蛋白收率方面CrystaroseC FF的蛋白總收率比Chelating FF高14%左右。分(fēn)析其原因有(yǒu)兩方面，其一，從SDS-PAGE圖上可(kě)以看到流穿液裏都有(yǒu)少部分(fēn)目的蛋白，其中(zhōng)Chelating FF的流穿蛋白明顯比CrystaroseC FF的要多(duō)。其二，Chelating FF在洗雜步驟也有(yǒu)部分(fēn)目的蛋白被洗脫而損失掉(圖3).

　　4.3 在色譜圖峰型方面，CrystaroseC FF的峰型更尖銳，洗脫峰更好(圖1、圖2).

　　5 色譜圖

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