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6xHis 标簽蛋白鎳柱純化方法 Protocol

發布時間: 2016-08-30

　　1、溶液準備：

　　1.1 結合緩沖溶液(Binding Buffer):10mM PB,500mM NaCl,10mM咪唑，PH7.4;

　　1.2 洗脫緩沖溶液1(Elution Buffer1):10mM PB,500mM NaCl,50mM 咪唑，PH7.4;

　　1.3 洗脫緩沖溶液2(Elution Buffer2):10mM PB,500mM NaCl,250mM 咪唑，PH7.4

　　1.4 洗脫緩沖溶液3(Elution Buffer3):10mM PB,500mM NaCl,500mM 咪唑，PH7.4

　　1.5 變性緩沖溶液：10mM PB,500mM NaCl,8M尿素，PH7.4;

　　1.6 CIP溶液：0.5M NaOH,1M NaCl

　　1.7 層析填料：Ni Crystarose FF

　　2、樣品準備：

　　2.1 原核胞内可(kě)溶性表達樣品：

　　a)細菌經過誘導表達後，用(yòng)高速冷凍離心機離心(7000rpm,30min),棄上清。

　　b)用(yòng)Binding Buffer重懸菌體(tǐ);

　　c)超聲波破碎機裂解30分(fēn)鍾;

　　d)10000rpm低溫離心15min,取上清;

　　3、 6xHis标簽蛋白親和層析

　　3.1 平衡，用(yòng)5倍體(tǐ)積的Binding Buffer平衡層析柱;

　　3.2 上樣，流速150cm/h;

　　3.3 洗柱，用(yòng)3---5倍體(tǐ)積的Binding Buffer沖洗層析柱直到和基線(xiàn)平行，流速為(wèi)300cm/h;

　　3.4 洗雜，用(yòng)Elution Buffer1沖洗層析柱3-5個體(tǐ)積，此時洗脫下來的都是雜蛋白和核酸等雜質(zhì)，流速300cm/h

　　3.4 階段洗脫，用(yòng)Elution Buffer2和Elution Buffer3分(fēn)别洗脫，收集洗脫液。

　　4、 CIP

　　4.1 用(yòng)去離子水沖洗層析柱5---10個體(tǐ)積，流速為(wèi)600cm/h;

　　4.2 用(yòng)5倍體(tǐ)積的CIP溶液沖洗層析柱，流速為(wèi)75cm/h,此時流速不宜太快，防止損壞柱子，

　　4.3 先用(yòng)去離子水低流速沖洗層析柱5個體(tǐ)積，流速為(wèi)75cm/h,在用(yòng)去離子水高流速沖洗層析柱5個體(tǐ)積，流速為(wèi)600cm/h;

　　4.4 用(yòng)20%乙醇溶液沖洗層析柱5個體(tǐ)積，流速為(wèi)300cm/h.

　　4.5 保存。

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